蛋白质定向进化是生物技术领域的重要工具，通过模拟自然进化过程，在实验室中快速优化蛋白质功能。然而，传统方法如易错PCR存在耗时长、效率低、突变库多样性受限等问题。近年来，基于CRISPR-Cas或T7 RNA聚合酶的突变系统虽取得进展，但仍面临突变范围小、宿主普适性窄等挑战。在非模式生物（如嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis）中，缺乏高效的蛋白质定向进化工具，限制了其在工业生物技术中的应用。如何开发一种高效、高特异性、广宿主兼容且能同时引入多种突变类型的系统，成为亟待解决的难题。
近日，清华大学陈国强教授团队在《自然通讯》（Nature Communications）发表题为“一种产生全部转换突变的正交转录突变系统用于体内加速蛋白质进化”（An orthogonal transcription mutation system generating all transition mutations for accelerated protein evolution in vivo）的研究论文，开发了一种正交转录突变系统（OTM）。该系统通过将三种广宿主兼容性的噬菌体RNA聚合酶（MmP1/K1F/VP4）与两种脱氨酶（PmCDA1和TadA变体）巧妙融合，构建了一个高效、模块化的蛋白质进化平台。其核心设计原理在于：RNA聚合酶在转录过程中解旋DNA形成单链区，而融合的脱氨酶则能对暴露的单链DNA进行编辑，实现C:G-T:A和A:T-G:C类型的碱基突变。该系统能在短短1天内完成蛋白质的定向进化，突变效率较自发突变提升达150万倍。
在这项研究中，研究人员采用XTEN柔性连接肽分别将胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶与噬菌体RNA聚合酶融合，构建了分别能够产生C:G-T:A和A:T-G:C类型碱基突变的正交转录突变元件。同时通过添加尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）和优化诱导条件，使突变效率提升150万倍，而脱靶率仅增加65倍。
进一步，通过将两种脱氨酶与噬菌体RNA聚合酶进行合理组合，研究人员构建了能够同时引入C:G-T:A和A:T-G:C突变的双功能正交转录突变元件。通过在目标基因上下游分别插入噬菌体启动子，研究人员成功实现了突变在目标基因上的均匀分布，克服了单个启动子策略中突变偏向启动子近端的局限性。此外，正交性实验结果表明，基于不同噬菌体RNA聚合酶的正交转录突变元件能够特异性识别各自启动子，避免交叉干扰，从而为之后的模块化设计提供可能。在宿主适用性方面，该系统在非模式生物（如嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis）和模式生物（如大肠杆菌E.coli）中均表现出色，解决了现有工具在非模式生物中效率低下的难题。
在实际应用方面，该系统展现了强大的潜力。研究人员通过突变荧光蛋白和色素蛋白，成功获得具有多种不同颜色的细胞；通过靶向突变细胞骨架和分裂相关蛋白，获得了具有超长杆状、球形和其他多种形状的工程菌株，为形态学工程改造提供新的思路；在工业应用场景下，通过一轮突变进化σ70全局转录调控因RpoD和赖氨酸外排蛋白LysE，成功获得能够增强L-精氨酸耐受性和转运能力的突变体。
图1：正交转录突变系统的设计、优化与应用
总之，正交转录突变系统具有高突变效率、高特异性和低脱靶率的优点，在实际进化过程中仅用1天即可完成以往需要数周才能实现的蛋白质优化过程。特别值得关注的是，该系统在模式和非模式生物中均展现出优异的性能，有效解决了现有工具在非模式工业菌株中应用受限的困境。
展望未来，该技术仍有广阔的拓展空间和应用前景。一方面可以尝试整合其他突变类型的脱氨酶，进一步丰富突变库的多样性；另一方面可以探索该系统在其他非模式生物中的兼容性和适用性。在应用层面，该突变系统可以应用于加速生物制造（如PHA生产）中关键酶的优化，推动绿色生物经济发展。
6165cc金沙总站检测中心陈国强教授为论文通讯作者，生命学院2022级博士生邵明威为本论文第一作者。其他作者还包括陈国强实验室的科研助理张忠楠，博士后金晓帆和2023级博士生丁军。相关工作获得了国家自然科学基金和清华北大生命联合中心的基金支持。
文章全文在线连接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-61354-4
